来看看酸菜的国自然研究方案独家套路

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2018-12-20 23:12:42
                                                                                                   
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作者:酸菜(转载请注明:解螺旋·医生科研助手)

先来复习下《酸菜的模块化写作》中的总纲

酸菜路径:立项依据→研究内容→研究目标特色与创新→关键科学问题→研究方案→技术路线→摘要。(点击相应内容可查看

上期我们说到了特色与创新与关键科学问题,今天接下去讲讲研究方案的套路。评审基金的关注点一直都是工作基础和思路,哪有空研究实验如何分组、检测什么指标和用什么仪器?所以这些都可以在前人的工作上进行“拿来主义”,当然,还是要稍作改动的。

酸菜的研究方案依然可以从临床、细胞、动物分子四个层次进行设计,划分为3-4个部分,可谓一招鲜吃遍天。

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探讨X的表达与临床因素及预后的相关性,明确临床意义

需要考虑收集什么样本,应用什么实验方法,检测什么指标,最后如何统计数据。尤其是外科医生,找上几百例标本,做做免疫组化的蛋白检测,然后多因素分析、生存分析,套路是比较熟悉的。

阐明X的功能角色,理解X表达改变与疾病相关内在原因

功能表型的研究一般以细胞模型为平台,将细胞分为对照和病理模型两种,或者模型上增加干预因素(加药或分子操作),然后利用一些检测方法和数据指标来评估研究对象的变化。肿瘤研究之所以火热,很大程度上是因为大量稳定的细胞、动物模型以及观察指标的试剂盒,比如凋亡可以用TUNNEL和AnnexinV的试剂盒,转移可以用Transwell实验检测,一样有试剂盒,无需操心建立方法学的难题。

根据RobertA. Weinberg在2011年那篇里程碑综述Hallmarksof Cancer: The Next Generation,肿瘤有以下典型的生物学行为:①维持增殖信号;②逃避生长抑制;③侵袭与转移;④无限复制能力;⑤诱导血管新生;⑥抵抗细胞死亡;⑦免疫逃逸;⑧能量代谢失调;⑨基因组不稳定与突变;⑩炎-癌转化,

相应的常用检测方法列举如下:

细胞增殖/存活:MTT、CCK8、Brdu
细胞迁移:划痕愈合、Transwell小室
细胞周期:PI染色流式检测
细胞凋亡:AnnexinV//PI双染色流式实验、线粒体膜定位、DAPI染色
血管新生:Transwell血管形成、动物模型、血管形成标记检测
基因编辑:shRNA(基因敲减)、CRISPR/Cas9(基因敲减、敲除、突变)
炎癌转化:炎症因子的表达检测、细胞形态观察

上述观察指标中,常用的动物模型有:

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  • 移植性肿瘤模型(常用的裸鼠品系有Balb/c、NOD/SCID等);
  • 自发性肿瘤模型(如MMTV-PyMT转基因小鼠:自发性乳腺癌肺转移动物模型);
  • 诱发性肿瘤模型(如使用强化学致癌物二甲基苯蒽(DMBA)和甲基胆蒽可诱发乳癌,二苯苄芘可诱发纤维肉瘤)等。


动物模型的建立和观察可以作为一节内容单独呈现,也可与细胞合并作为功能学研究一起放在实验方案中。

解析X发挥作用的分子机制,从而回答X如何调节功能的问题

分子机制是国自然研究内容的重头戏,自然也是研究方案中突破的关键,往往占到至少一半的工作量。医生们写到这一部分的时候经常感觉抓耳挠腮,无从下手。我觉得梳理分子机制的话可以再读一读解螺旋的一篇文章(中心法则虐我千万遍~),从中寻找灵感。

说起来并不复杂,从DNA到RNA,我们称之为转录,从RNA到蛋白,称之为翻译,经常被研究的机制模式主要有:

①X影响Y从DNA到RNA的转录;
②X影响Y的RNA转录后调控;
③X影响Y从RNA到蛋白的翻译过程;
④X影响Y翻译后的修饰。

上述这些调控都能够最终导致Y蛋白(功能的执行单位)发生表达或活性的改变,最终影响功能。

第一种模式中最令研究者痴迷的是一类叫转录因子的分子,因为能够调控多个基因的转录过程,被认为像开关一样的存在,如果你所研究的靶分子据报道有DNA结合的结构域和转录因子活性,那么你的分子机制研究方案无疑要围绕如何筛选和鉴定靶分子能够结合的DNA序列以及调控的下游分子。

第一种模式常见筛选和验证方法:

  • 敲减/过表达或者突变x后检测Y的mRNA水平(预实验);
  • 用Luciferase实验验证X对Y的调控;
  • ChIP筛选/验证蛋白-DNA的结合。

第二种模式目前非常火热,因为发现了很多转录后调控的分子机制,比如miRNA,ncRNA等等,而本身RNA成熟也需要在前体之上的加工和剪切。我想今年写lncRNA的小伙伴肯定不少,所以对于一个基因的mRNA因为与其他RNA分子结合导致翻译抑制的机制。别忘了,lncRNA也可以直接调节转录或者翻译过程,按图索骥吧。

第二种模式常见筛选和验证方法:

  • 敲减/过表达或者突变x后检测Y的蛋白水平(预实验);
  • 用Luciferase实验验证X对Y的调控;
  • 用X的拮抗物(如miRNA inhibitor)拮抗x后,检测Y的表达。

第三种模式同第一种类似,这类分子称为翻译因子,研究的热度逊于转录因子,但因为近期也有翻译因子的分子靶向药物问世,也不失为一个值得关注的方向。翻译因子结合的序列是RNA,经常采用蛋白钓RNA的策略,或者反过来,方法学上也比较成熟。

第三种模式常见筛选和验证方法:

  • 敲减/过表达或者突变x后检测Y的蛋白水平(预实验);
  • 通过RIP的方法筛选/检测蛋白与RNA的结合。


第四种模式最为人所熟知的是蛋白的磷酸化修饰,当然蛋白的修饰方式还有很多,影响其功能、定位、甚至是归宿。在蛋白水平研究机制在RNA调控大热之前一直是主流,即使现在也完全不会落伍。酸菜所在实验室就喜欢用蛋白-蛋白相互作用来研究机制,实验方法稳定可靠,有时候你做惯了一种套路,你总会难以割舍。

第四种模式常见筛选和验证方法:

  • 敲减/过表达或者突变x后检测Y的磷酸化(也可以是乙酰化、糖基化等)(预实验);
  • 酵母双杂或者Co-IP、GST-pulldown等实验验证蛋白-蛋白相互作用;
  • 细胞免疫荧光(或细胞组分分离分别检测蛋白表达)检测XY的共定位。

关于分子机制研究的奥妙真的可以说上一整天,但我想作为医生也不必学贯中西以致抢科学家们的饭碗。如果说分子机制研究模式还有什么重要信息要交代的话,我只想补充一点:上面谈到X影响Y,有时候研究对象也可以聚焦到Y:把Y作为靶分子,研究什么因素调控它,即上游的机制,与X作为靶分子,研究它调控什么,即下游的机制,其中便蕴藏的丰富的变化了。别晕,再复杂也就这点套路了。

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